В процессе реакции масло вначале нагревается до определенной температуры (для ускорения реакции), а затем в него добавляется катализатор и спирт. Если применяется метанол — образуется метиловый эфир, если этанол — этиловый эфир. Для ускорения реакции также может применяться кислота. Смесь определенное время перемешивается и отстаивается. После отстаивания смесь расслаивается, образуя биодизель в верхнем слое (называемый химически «эфир»), затем слой мыла и на дне остается глицерин. Глицерин и мыльный слой впоследствии отделяются, а биодизель промывается различными способами для удаления остатков мыла, катализатора и других возможных примесей. После промывок он осушается для удаления остатков воды, например, сульфатом магния. Затем осушитель удаляется простой фильтрацией. Из одной тонны растительного масла и 111 кг спирта (в присутствии 12 кг катализатора) получается приблизительно 970 кг (1100 л) биодизеля и 153 кг первичного глицерина.

После завершения реакции на дне осаждается глицерин. Биодизель должен быть цвета меда, глицерин – более темного цвета. При поддержании температуры около 38 градусов глицерин остается в жидком состоянии и может быть легко удален снизу смесителя отдельным шлангом. Глицерин, полученный из отработанных масел, обычно коричневый и твердеет при температуре 38 градусов, глицерин из свежего масла остается в жидком состоянии при более низких температурах. Его можно использовать как побочный продукт, предварительно выпарив из него метанол нагреванием до 65,5 градусов.

Качество получившегося продукта определяется, прежде всего, визуально и проверкой рН. На вид биодизель должен выглядеть как чистое подсолнечное масло. Не допускается наличие никаких взвесей, примесей, частиц или замутнений. Мутность означает присутствие воды, которая удаляется нагреванием. После первого применения биодизеля обязательно следует проверить топливные фильтры.